کلون کردن ژن ‏‎s‎‏ و ناحیه ژنی ‏‎pre s2‎‏ کدکننده آنتی ژنهای سطحی ویروس هپاتیت ‏‎b‎‏ در سلولهای یوکاریوتی پستانداران سویه ‏‎cos7‎‏

با توجه به اهمیت واکسن هپاتیت ‏‎b‎‏ از نظر بهداشتی و پیشگیری از عفونت ویروس هپاتیت ‏‎b‎‏ و عوارض مزمن کبدی و سرطان کبد، با تهیه این واکسن در داخل کشور می توان کلیه افراد جامعه را تحت پوشش واکسیناسیون قرار داد. با توجه به مشکلاتی که در تهیه واکسن از راه پلاسما وجود دارد، تهیه واکسن سنتیک از طریق روشهای نوترکیبی، نظرها را به سوی خود جلب کرده است. آنچه که امروزه بعنوان واکسن سنتتیک تجاری در بازار رایج است، واکسن حاصل از مخمر است. منتها گزارشات نشان می دهند که تا میزان 5-15% افراد واکسینه شده با واکسنی که بطور ‏‎recombinant‎‏ در مخمر تولید می شود، پاسخ مثبت نشان نمی دهند که علت این امر به نوع ‏‎folding‎‏ در مخمر بستگی دارد. زیرا نوع آنتی ژن که در انسان از طرف ویروس ساخته می شود، بدلیل ساخت در شبکه آندوپلاسمیک، ‏‎folding‎‏ و مدیفیکاسیون این آنتی ژن دارای ویژگیهای انسانی می باشد. بنابراین تولید این آنتی ژن در سولهای پستانداران می تواند به میزان افراد فوق الذکر در جهت مقابله با ویروس کمک کند. گزارشات نشان می دهند، واکسنهای هپاتیت شامل ناحیه آنتی ژن سطحی ‏‎pres‎‏ در ترکیب با ناحیه ‏‎s‎‏، ایمونوژن تراز واکسن هایی است که فقط شامل ناحیه ‏‎s‎‏ هستند و این واکسنها باعث بروز پاسخ ایمنی در افرادی می شود که نسبت به واکسن های فقط شامل ناحیه ‏‎s‎‏ جواب نمی دهند. از این رو در این تحقیق سعی شده که 2 ژن کدکننده ناحیه ‏‎s‎‏ و ناحیه ‏‎pres2+s‎‏ جهت کلون کردن در سلولهای یوکاریوت بکار گرفته شوند تا در تحقیقات بعدی با بررسی بیان این ژنها در سلول یوکاریوتی و مقایسه ایمونوژنیسیته آنها از نوع ایمونوژن تر در جهت تولید انبوه استفاده گردد. بدین منظور 2 ژن مربوط به آنتی ژن سطحی ویروس بنام ژن ‏‎s‎‏ کدکننده ‏‎major pr‎‏ و ‏‎pres2+s‎‏ کدکننده ‏‎middle pr‎‏ استفاده شد. از این رو، آغازگرهای مناسب جهت جدا کردن این 2 ژن از پلاسمید ‏‎pbrhbadr72‎‏ طراحی شد و با تکنیک ‏‎pcr‎‏، ژنهای مربوطه جدا گردیدند و در پلاسمید پروکاریوتی ‏‎pbluescript ii ks(+)‎‏ کلون شدند. سپس با آنزیمهای برشگر مناسب جدا شده و در وکتور یوکاریوتی ‏‎pcdna3 کلون شدند و پس از اطمینان از قرارگیری مناسب آنها در پلاسمید توسط آنزیمهای مناسب از طریق تکنیک ‏‎transfection‎‏ با روش کلرید کلسیم به سلولهای یوکاریوتی ‏‎cos7‎‏، ترانسفر شدند. در ضمن کلونهای پروکاریوتی و یوکاریوتی حاصله هر یک بطور جداگانه توسط 2 آنزیم پلیمرازی ‏‎taq polymerase‎‏ و ‏‎pwo‎‏ بهنگام ‏‎pcr‎‏، ساخته شده اند.